光密度值和灰度值如何在Western Blot条带定量和凝胶图像分析中应用?

       在 Western Blot条带定量分析时，到底是分析图像的光密度（Optical Density, OD）还是图像的灰度值（Grey Levels，GL）？

       有观点认为灰度与光密度两种量化方法都行，随意。有人提出WB一般分析都是积分光密度（Integral Optical Density，IOD）。还有的提出灰度应逐渐被光密度或吸光度取代^［1］。

       就此问题，阿拉斯加科技基于PubMed进行了专题调研。分别采用grey Level + western blot和optical density + western blot两组关键词，检索区域限定为[Text Word]和发文时间[PDat：2016/01 - 2021/01]。了解近5年发文中国内外学者的对此问题“主流”意见。对检索记录初步整理，结果如下：

(数据来源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)

      检索结果显示，在western blot图像分析中，采用图像的grey Levels值与采用optical density值分析的论文数量比为1:276。把发文时限前推至2011/01后，则这一比例为255:18124 = 1:71。换言之，前5年基于光密度值分析的论文比例为98.6%，后5年该比例微升至99.6%，仅0.4%的论文采用条带灰度值分析。坚持WB条带定量分析图像灰度值论者，俨然成了当今的“濒危保护”人群。

      对这87篇基于图像灰度值进行WB条带定量分析的论文简单梳理后发现，部分文章发表在诸如CANCER CELL (2019 IF 26.602)，CELL RES (2019 IF 20.507)，NAT COMMUN (2019 IF 12.121)，THERANOSTICS (2019 IF 8.579，Clin Transl Med (2019 IF 7.919)，BRIT J PHARMACOL (2019 IF 7.73) 等影响因子颇高的著名期刊上。据此看来，基于两种图像强度值数据的分析方法，并无先进落后之分，仅仅是使用人群的大小众的问题。

      那为什么眼下呈现一边倒用光密度值而非灰度值做WB图像的条带定量分析？要回答这个问题，还要从光密度和灰度的本质涵义说起。

1. 图像灰度值

      无论CCD还是CMOS传感器，原理都是光子照射在图像传感器光敏面上产生光电效应，像素上激发出电子。在曝光时间内，电子持续生成并在内部电容不断积累形成电压信号。电路对每个像素电压信号进行放大和模数转化等处理，每个像素对应的光信号用一个0-255之间某个相应数值表示：0表示黑-没有光信号，255表示白-光信号强度最大，用1-254值表示处于黑白之间的颜色深浅（灰度）。这样形成了反映拍摄对象各部光线强弱（灰度值）的二维阵列，最终图像灰度值以数字信号形式输出，即输出了数字化图像。

      因此，图像灰度值代表源自于样品反射的照明光源（reflective light）、自发荧光或外部激发标记荧光、样品的生物发光和化学发光等光信号强弱。样品发射的光信号越强，像素获得的光子和集聚的电信号越强，形成的像素灰度值越高，生成的数字图像对应的像素越亮。这样，图像亮度（灰度值大小）与可发光样品多少即浓度/含量，存在关联（正相关）。

      故在凝胶成像分析仪对于采用EB、GelGreen，SYBR Green，SYBR Safe等标记的和SYPRO Ruby蛋白凝胶的荧光染料激发荧光、自发荧光，Western Blot印迹膜HRP-ARP化学发光样品采集的图像，应该采用灰度值分析法分析。

2. 图像光密度值

      要说清光密度（Optical Density, OD）的涵义，还须从比尔-朗伯定律（Beer–Lambert law）或朗伯-比尔定律（Lambert–Beer law）开始。

      朗伯-比尔定律是光通过物质时被吸收的定律，作为吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础理论，适用于电磁辐射和所有吸光物质（包括气体、固体、液体、分子、原子和离子）。其物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀、非散射吸光介质体系时，因介质吸收了一部分光能，在透过一定厚度介质后，透射光的强度减弱。如介质中的吸光质点之间无相互作用，入射光与介质内部之间的作用仅限于光吸收,无荧光和光化学现象发生，且介质的吸光度在0.2-0.8之间。此时比尔-朗伯定律数学表达式成立：

      其中：I为透射光强度，I0为入射光强度；吸光度(Absorbance, A)指光线通过溶液或介质前的入射光强度I0与该光线通过溶液或物质后的透射光强度I比值的对数.

      而光密度(Optical density, OD)同样定义为入射光与透射光比值的对数。故本质上，光密度(OD)等同吸光度(A)［^2］。

      光吸收介质的浓度愈大，厚度愈厚，则入射光穿透介质后光强度的减弱愈显著，对应的吸光介质的吸光度（光密度）越大。光路上样品浓度/含量大，则光密度大，落实到光学成像上，光密度扫描仪和凝胶成像分析仪等采集到的图像越暗。

      标准光密度法适用于采用透射光(transmitted light)成像检测获取的图片的量化分析^［2］。即：进入图像传感器采集的光信号与检测入射光线为同一束光（而非样品经入射光激发后产生的荧光、自发荧光或生物、化学发光），样品含量与对检测入射光的吸收削减作用呈线性关系，都可以基于图像的光密度值进行量化分析。

      根据比尔-朗伯定律，凝胶成像分析仪使用白光转换板采集的考马斯亮蓝染色蛋白电泳凝胶图像，比色分析实验图片和采用光密度仪扫描采集的放射线自显影胶片图像，应该采用图像光密度值为依据进行量化计算^［2］。

      如入射光与吸光介质内部之间并非限于光吸收,同时激发产生了荧光（如入射光源为302nm紫外光，激发核酸标记EB染料后发射595nm波长橙红色荧光），或有光化学现象发生，此时，图像感光器接收的光信号，比尔-朗伯定律不再适用。

3. 光密度与灰度的转换关系

      数字化图像记录的是各像素的灰度值，但不同样品因成像机制不同，图像的黑与白所代表的含义存在根本区别。因此，应回归图像本来内涵，选择到底是基于图像的光密度值抑或图像的灰度值，对图像进行量化统计分析。

      在软件ImageJ 1.46r的操作指南中^［2］ ，专门给出了像素未经校正的初始光密度值（Uncalibrated OD）和像素灰度值间的转换公式。即：

       而UVP VisionWorks LS软件操作指南^［3］中，给出图像特定像素P(x,y) 经校正后OD值与像素灰度值的计算公式如下：

      当P(x,y) < black（即黑色图像白色背景）时：

       其中，Incident =整个图像中最亮的像素值，Black =整个图像中最暗的像素值。

      当P(x,y) ＞black（即白色图像黑色背景）时，公式2可表述为：

       比较发现，公式1和公式2、3，本质含义一致的。

       两个软件给出的公示传递的信息是：

       无论暗底亮条型图像（如Western Blot原始图像、EB等荧光染料标记的DNA电泳凝胶图像），还是亮底暗条型图像（如经典的采用放射性自显影方法检测的Western Bot底片图像，可见光照明下考马斯亮蓝染色、银染的蛋白凝胶图像），计算机记录的是图像像素强度值（pixel value）都是灰度值（grey Levels）。

       可见，不同实验图像，无论是普通凝胶图像，还是Western Blot条带图像，灰度值所代表的内涵并不一致。

       提示，在对图像量化分析时，所分析图像强度值，到底是像素灰度值，还是光密度值来，必须结合图像本身属性，心中有数。WB条带定量中到底是分析图像灰度值还是光密度值，泛泛而谈则毫无意义。

4、结语

       把NIH在生物医学界人士心中的地位比作阿拉伯民众眼中的麦加城，并不为过。但凡研究生开始就从NIH的PubMed数据检索和免费便捷下载服务受益的生物医学研究者，对NIH信息平台服务的信赖，是不言而喻的。
       20世纪80年代初，为解决x光片图像分析处理难题。NIH的程序员韦恩•拉斯班德（Wayne Rasband）编写了ImageJ分析处理软件，从此，研究人员得以在计算机上查看和分析数字图像。

       这款软件因为功能强大、权威性和无偿分发使用模式，其图像分析应用的影响力，早已超越生物医学图像范畴，被拓展到到诸如地质地理、材料科学、农业食品、城市建设、园林绿化等等众多领域。2021年，Nature杂志将ImageJ列为改变科学10个计算机代码项目之一，可见一斑。
       本文得以成文，也正是受ImageJ的User Guide启发的结果。
       关于Western Blot条带定量分析到底是基于条带光密度还是灰度值的问题，总结起来三句话。
1）因图制宜
       暗底白带型WB条带图像的分析值，理当是基于图像的灰度值GL；而目前发文中千篇一律的浅底暗带图片（仿经典放射性自显影风格），分析时理应将原始灰度值数据转换为OD值后再分析比较。至于有学者认为图像分析扬弃图像灰度值分析法，我们认为：要依图片属性来定。
2）实事求是
       发文如提供了图像强度（Density / intensity）统计分析指标，则应跟于上一条的规则，明确分析数据是条带图像的OD还是GL，不可张冠李戴混为一谈。
3）灰度分析靠谱
       在ECL法学发光成像的原图直接采用选区灰度值进行量化分析，不仅方法没错，事实上基于灰度值的统计分析完全可行。详情可参考《图像灰度值在Western Blot条带定量分析中应用实测》（上、下）。

参考文献：

1. 李枫.图像分析中光密度参数物理意义的正确理解和使用.解剖学杂志，2009,32(2):271-274

2. ImageJ IJ 1.46r User Guide

3. Life Science Software Installation and User Instructions Rev L (81-0254-01)