混沌若教休凿窍-细胞冻存管外形尺寸差异在不同应用模式下对温控性能的影响-下篇

（前续：细胞冻存管外形尺寸差异在不同应用模式下对温控性能的影响-中篇）

三、细胞治疗技术应用时代冻存管产品的技术创新与突围

       近十余年来，脂肪组织来源的间充质干细胞（Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, AdMSCs）作为基因细胞疗法 (Cell and gene therapy, CGT)最具吸引力的干细胞来源，已被大量用于治疗包括癌症、自身免疫性疾病、心脏病和糖尿病等在的多种疾病。在人体脊髓损伤治疗试验中，患者一次性静脉注射自体hAdMSCs剂量达到4×10⁸个细胞 ^[3] 。采用胰岛移植疗法的70公斤体重1型糖尿病患者的胰岛输入当量为7×10⁵ - 1×10⁶个细胞 ^[4] 。CGT技术应用的开展，激发了干细胞、组织类器官大规模扩增技术和样品冻存复苏新技术的研究开发热潮。

       然而数十年来，冻存管除推出SBS标准编码管外，新制式冻存管推出和应用几近空白。一边是高度同质化产品产能井喷，一边是OEM品牌雨后春笋般涌现。全行业从生成到流通，多数厂商在低效益模式中煎熬，创新乏力。

       CGT时代浪潮下，应找准方向，积极创新产品，实现冻存管产业由低水平重复制造向高附加值产品“智造”转型，才能增强产品在国内、国外两个市场的竞争力，提高服务效益。我们认为至少以下三个方面是可有尝试的。

3.1 细胞冻存管容量的扩容

       调研显示，商品化细胞株，如IMR-90，常用1mL冻存管、T25细胞培养瓶两种封装形式进行流通。冻存管封装时通常用浓度1×10⁶ Cells/mL细胞悬液每管1.0mL的形式分装出售。

       T25细胞培养瓶，以Nunc EasYFlask T25 细胞培养瓶(156340)为例(（培养面积25cm2，培养液体积5-7.5mL），可容纳2.5×10⁶个细胞贴壁。培养瓶细胞容量大、密封性好，便于运输。如改用Nunc Nunclon Supra 6孔细胞培养板封装（140680，每孔面积约 9.6cm²，培养液量2–2.5 mL），细胞容量约8×10⁵个。这两种封装方式细胞以稳定贴壁的状态交付用户，解冻后更换培养基可原位继续培养，有助于维持细胞贴壁状态和细胞活性。

       而据报道，原位贴壁培养于6孔培养板中的人胚胎干细胞（hES）集落，用常规缓慢冷却法（即Mr. Frosty或CoolCell LX细胞梯度降温盒法）、10%（体积/体积）DMSO浓度条件下，经冻存复苏循环后，细胞存活率低至5%。这一比例与通过酶解保存于冷冻管中的hES团块冻融后存活率相当 ^[5] 。这一方面说明常规hES冻融技术方法还无法满足细胞规模化应用需求。也表明，干细胞可用细胞培养表面6孔培养板原位冻存或酶解后制成细胞悬浮液转入常规冻存管保存。

       T25培养瓶壁厚，而6孔培养板只有底板直接接触到液氮蒸气或37℃水浴，因此，两种细胞培养容器在冻融循环期间的温度动力学曲线，与细胞玻璃化转变前后所要求的稳定降温、快速复温解冻要求有差距，不利于降低冻存有关的细胞损伤风险。

       研究证实，hES在解冻5分钟后，贴壁集落中98%的hES细胞具有活性。而当hES集落转入37℃培养时，其存活率显著下降。但如维持在4℃条件下则活性下降严重程度明显减轻。在4℃条件细胞死亡动力学减缓现象具有一定可逆性，温度恢复至37℃时，细胞存活率随时间推移呈现急剧下降现象。hES复苏培养后细胞活性下降、死亡现场，属于冻存相关的细胞延迟性死亡，在hES集落的常规连续传代过程中十分常见。分析指出，hES为需要协同相互作用的“社会性”细胞，贴壁集落中hES集落内存在的大量紧密连接和间隙连接，对维持细胞活性状态极为重要。解离或不恰当的冻融操作，会损伤集落内部的缝隙连接结构而造成细胞损伤甚至凋亡。研究表明，在连续传代过程中，应特别注意确保hES集落以温和方式解离为相对较大的细胞团块。如通过重分酶解和吹打将集落解离成单细胞或10个细胞的小簇状结构，会严重损害其体外存活与增殖能力 ^[6] 。研究表明，由100个细胞规模的hES团簇最有利于hES集落生长和扩增 ^[7] 。

       这说明，CGT应用时代，细胞材料收培养、冻存处理，与数十年前普遍采用的流程方法已然有所不同。对于细胞冻存容器有特殊内在需求，容量要扩展以便于单管内容纳更多的细胞团簇，同时还改进管热动力学响应性能。

       今天，当我们重新审视这一问题时，越发觉得Nalgene 5005-0015旋盖冻存管设计思路，即容量15mL、平底、外径33mm、带盖高度47mm（1.81 in.，与标准液氮/超低温冰箱冻存架兼容）的前瞻性和借鉴价值。

       无锡耐思在国内率先推出了6mL（φ17.8mm, H57.5mm）、8mL（φ17.8mm, H71.7mm）的冻存管，可视为一种积极尝试。但还应改进管与细胞低温实验设备的可兼容性和管热力学响应性能。

3.2 细胞冻存管外型的简约化

       从细胞冻存管实际使用场景特点、生产资源利用效能和减轻管理负担角度看，管外形设计有简约化必要性。

       首先，无论大型生物样品库、个人实验室细胞间，细胞样品的分装、移液等操作无不在洁净环境下操作。内旋与外旋盖管，在操作便利性和防污染性能上，并无本质差异。综合冻存管对机器自动开盖、手动开盖器开盖与手动旋盖操作适用性，可以优先考虑外旋盖设计。

       其次，与1.5mL、15ml、50mL锥形管可以直接离心以收集细胞沉淀不同，冻存管底部特殊外型使其难以直接安全离心。而目前配置有可直接离心冻存管的转头及适配器的离心机殊为罕见。故绝多数情况下，冻存管样品解冻后，人们只能将细胞样品转入15mL锥形管再离心。这样细胞复苏后的操作时间延长，离心管和移液吸头消耗增加。圆底冻存管，不仅在程序降温应用上热传导效率高，在开发离心管适配器方面还具有技术难度低、离心安全高的优势。

       此外，获得既可消毒灭菌又能有效固定冻存管的管架不容易。若将细胞冻存管装入开盖冻存管盒，则确保移液加样操作时管身保持竖立，比可自立管更稳定和不易发生倾倒。故管底支脚，不仅无足轻重，在梯度降温盒冷却等特殊应用场景中反而是种累赘。因此，应精简带支脚的多款可立式冻存管产品线，保留SBS标准管薄底设计，既改进管底低温条件下热导效率，又便于预制2D码。

       冻存管尺寸规格方面，重点围绕8.8mm、12.8mm两种规格设计新型冻存管的好处，显而易见。

3.3 细胞冻存管配套产品的开发

       细胞冻存管核心功能固然是服务于深低温样品储存。但升温解冻完成后，通常需在较低温度下及时去除冷冻溶液并在PBS清洗后，再迅速转入CO2培养箱环境，以降低细胞在非理想生长条件下的暴露时间。

       为此，2008年，Beckman公司在推出ALLEGRA X-12离心机时，为简化大量培养细胞换液的操作流程、减少细胞在培养箱外暴露时间，开发了75cm²、25 cm²斜颈细胞培养瓶的转头适配器，一轮运行可离心4个Corning T75瓶或8个T25瓶，这样细胞培养瓶换液操作无需经15mL、50mL尖底离心管中转过程，速度大幅提升。此后，这种新型适配器又在Thermo、eppendorf品牌离心机中成功开发。另一个典故来自BD公司。BD虽非离心机生产商，但在推出Falcon 175mL、225mL锥形离心瓶的同时，开发了锥形离心瓶专用V型衬垫，以便在250mL角转头中安全离心。可见，产品的开发设计不应止步于业内相同功能的实现，应将产品代入应用场景，在产品应用便利化上创新，实现差异化产品品质和服务。

       长期以来，冻存管因管径、管底特殊外形异于普通离心管的原因，多数条件下都无法直接离心及时将复苏细胞与样品内冷冻保护液分离。Eppendorf公司2002年为新上市的5702R低速离心机、5430R高速离心机开发了F-45-18-17-Cryo型角转子，用于Ø13 mm、最大长度50 mm的1 – 2 mL 冻存管离心。该转头离心孔孔径17mm，添加管套适配器后即可有效支持12-13mm管径冻存管离心。可见，为冻存管适配器使其可以直接上机离心的便捷化服务理念，早有先行者在践行。                                              

        0.5mL SBS标准细胞冻存管，管径8.6-8.8mm。而非SBS标准管管径集中分布于12.3-12.85mm，管径超过常规eppendorf 1.5mL管（Ø10.8mm/H41mm），与SBS标准1.0-5.0mL冻存管管径12.8mm存在重叠。

       目前科研、临床实验室离心机，具有水平转头并配置15mL锥形管（Ø17 mm/H120mm）、10mL采血管（Ø17 mm/H105mm）或5-7mL采血管（Ø 13 mm/H106mm）适配器的情形极为普遍。因此，为15mL锥形离心管、5-10mL采血管适配器设计冻存管适配器是简便易行的方案。考虑到同一个系列冻存管管径一致而管长长短不同的事实，只需单一孔径冻存管适配器，即可满足同系列所有容量冻存管的离心使用。但6mL（φ17.8mm, H57.5mm）冻存管离心，则须使用为50mL (Ø29mm/H123mm)、85-100mL (Ø38mm/H123mm)角转头设计的适配器。考虑到实验室中50mL圆底管（Ø30 mm/H121mm）角转头的保有量相对较少，围绕这一转头开发适配器的适用性和市场前景远不如12.8mm管径冻存管适配器好。

       冻存管解冻复苏通常在37℃恒温水浴槽内进行。复苏期间，实验者需以圆周回旋方式柔和地振动冻存管，以实现并管壁始终接触到37℃水温，并加快管内液体对流达到冻品受热均匀目的。目前市面恒温水浴摇床体型过大、清洁维护不便、振荡频率下限过高、无法固定冻存管，不适合细胞复苏使用。开发冻存管专用夹具、以圆周回旋振荡、振动频率0-50Hz的小型恒温水浴摇床，看似为冻存管使用便利化迈出的一小步，确是新时代具有创新意义的一大步。

参考文献

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[2]T/ZZB 1653-2020一次性细胞冻存管（聚丙烯）

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[4]Li Zhan, Joseph Sushil Rao, Nikhil Sethia, et al.Pancreatic islet cryopreservation by vitrification achieves high viability, function, recovery and clinical. scalability for transplantation. Nat Med. 2022; 28(4): 798–808.

[5]Ji L., de Pablo J.J., Palecek S.P. Cryopreservation of adherent human embryonic stem cells. Biotechnol Bioeng. 2004; 88(3):299-312.

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